Sistema de edición de genes «mini» CRISPR diseñado: más fácil de administrar en células humanas para terapia génica

Los bioingenieros reutilizaron un sistema CRISPR «roto» para hacer una versión más pequeña de la herramienta de ingeniería del genoma. Su pequeño tamaño debería facilitar la administración a las células, los tejidos y el cuerpo humanos para la terapia génica.

La analogía común para la edición de genes CRISPR es que funciona como tijeras moleculares, recortando secciones seleccionadas de ADN. A Stanley Qi, profesor asistente de bioingeniería en la Universidad de Stanford, le gusta esta analogía, pero cree que es hora de reinventar CRISPR como una navaja suiza.

“CRISPR puede ser tan simple como un cortador o más avanzado como un controlador, editor, rotulador o generador de imágenes. Están surgiendo muchas aplicaciones de este apasionante campo ”, dijo Qi, quien también es profesor asistente de química y biología de sistemas en la Escuela de Medicina de Stanford y académico de Stanford ChEM-H.

Sin embargo, los diferentes sistemas CRISPR en uso o en ensayos clínicos para la terapia génica de enfermedades oculares, hepáticas y cerebrales siguen siendo limitados en su alcance porque todos padecen el mismo defecto: son demasiado grandes y, por lo tanto, demasiado difíciles de controlar. entregar en células, tejidos u organismos vivos.

En un artículo publicado el 3 de septiembre en Célula molecular, Qi y sus colaboradores anuncian lo que creen que es un gran paso adelante para CRISPR: un eficiente, multipropósito, mini Sistema CRISPR. Mientras que los sistemas CRISPR de uso común, con nombres como Cas9 y Cas12a que denotan varias versiones de proteínas asociadas a CRISPR (Cas), se componen de aproximadamente 1000 a 1500 aminoácidos, su «CasMINI» tiene 529.

Los investigadores confirmaron en experimentos que CasMINI podría eliminar, activar y modificar el código genético al igual que sus contrapartes más robustas. Su pequeño tamaño significa que debería ser más fácil de administrar en las células humanas y el cuerpo humano, lo que lo convierte en una herramienta potencial para tratar varias dolencias, incluidas las enfermedades oculares, la degeneración de órganos y las enfermedades genéticas en general.

Esfuerzo persistente

Para hacer que el sistema sea lo más pequeño posible, los investigadores decidieron comenzar con la proteína CRISPR Cas12f (también conocida como Cas14), porque solo contiene alrededor de 400-700 aminoácidos. Sin embargo, al igual que otras proteínas CRISPR, Cas12f proviene naturalmente de Archaea, organismos unicelulares, lo que significa que no es adecuada para células de mamíferos, y mucho menos para células o cuerpos humanos. Se sabe que sólo unas pocas proteínas CRISPR funcionan en células de mamíferos sin modificación. Desafortunadamente, CAS12f no es uno de ellos. Esto lo convierte en un desafío tentador para bioingenieros como Qi.

“Pensamos, ‘Está bien, millones de años de evolución no han podido convertir este sistema CRISPR en algo que funcione en el cuerpo humano. ¿Podemos cambiarlo en un año o dos? ‘”, Dijo Qi. «Hasta donde yo sé, por primera vez hemos convertido un CRISPR que no funciona en uno que funciona».

De hecho, Xiaoshu Xu, un erudito postdoctoral en el laboratorio de Qi y autor principal del artículo, no encontró actividad natural de Cas12f en células humanas. Xu y Qi especularon que el problema era que el ADN del genoma humano es más complicado y menos accesible que el ADN microbiano, lo que dificulta que Cas12f encuentre su objetivo en las células. Al observar la estructura computacionalmente predicha del sistema Cas12f, seleccionó cuidadosamente alrededor de 40 mutaciones en la proteína que potencialmente podrían eludir esta limitación y estableció una línea para probar muchas variantes de proteínas a la vez. Una variante de trabajo, en teoría, convertiría una célula humana en verde activando la proteína verde fluorescente (GFP) en su genoma.

«Al principio, este sistema no funcionó en absoluto durante un año», dijo Xu. “Pero después de las iteraciones de la bioingeniería, hemos visto que algunas proteínas diseñadas comienzan a activarse, como por arte de magia. Nos hizo apreciar realmente el poder de la biología sintética y la bioingeniería ”.

Los primeros resultados positivos fueron modestos, pero entusiasmaron a Xu y la animaron a seguir adelante porque significaba que el sistema funcionaba. En el transcurso de muchas iteraciones adicionales, pudo mejorar aún más el rendimiento de la proteína. «Comenzamos viendo solo dos células que mostraban una señal verde y ahora, después de la ingeniería, casi todas las células son verdes bajo el microscopio», dijo Xu.

«En un momento, tuve que detenerla», recordó Qi. “Dije ‘Está bien por ahora. Hiciste un buen sistema. Deberíamos pensar en cómo se puede utilizar esta molécula para aplicaciones ‘».

Además de la ingeniería de proteínas, los investigadores también diseñaron el ARN que guía la proteína Cas a su ADN objetivo. Las modificaciones de ambos componentes fueron fundamentales para que el sistema CasMINI funcionara en células humanas. Probaron la capacidad de CasMINI para eliminar y modificar genes en células de laboratorio humanas, incluidos genes relacionados con la infección por VIH, la respuesta inmune antitumoral y la anemia. Funcionó en casi todos los genes que probaron, con respuestas sólidas en varios.

Abriendo la puerta

Los investigadores ya han comenzado a establecer colaboraciones con otros científicos para buscar terapias genéticas. También están interesados ​​en cómo podrían contribuir a los avances en las tecnologías de ARN, como lo que se utilizó para desarrollar ARNm. COVID-19 vacunas, donde el tamaño también puede ser un factor limitante.

«Esta capacidad para diseñar estos sistemas ha sido deseada en el campo desde los primeros días de CRISPR y creo que hemos hecho nuestra parte para avanzar hacia esa realidad», dijo Qi. “Y este enfoque de ingeniería puede ser muy útil. Esto es lo que me emociona: abrir la puerta a nuevas posibilidades ”.

Referencia: «Sistema CRISPR-Cas en miniatura diseñado para el ajuste y la edición del genoma de mamíferos» por Xiaoshu Xu, Augustine Chemparathy, Leiping Zeng, Hannah R. Kempton, Stephen Shang, Muneaki Nakamura y Lei S. Qi, 3 de septiembre de 2021, Célula molecular.
DOI: 10.1016 / j.molcel.2021.08.008

Otros coautores del artículo de Stanford son los estudiantes graduados Augustine Chemparathy y Hannah Kempton y los académicos postdoctorales Leiping Zeng, Stephen Shang y Muneaki Nakamura. Qi también es miembro de Stanford Bio-X. el Instituto de Investigación en Salud Materno Infantil (MCHRI), el Instituto de Cáncer de Stanford y el Instituto de Neurociencias Wu Tsai. Esta investigación fue financiada por la Fundación Li Ka Shing.